在这种环境下，毛号召大力扩展，这或者是一次大胆的赌博，认为蒋不致投降日本；或者是一项紧急准备，尽可能争取有利地位，以防国共发生分裂。在华中，从1939年最后几个月罗炳辉的第五支队与高邮湖附近韩德勤的江苏军队发生冲突开始，战斗的规模和发展速度不断增长。在随后的几个月里，管文蔚的部队全部沿长江左岸运动，并与更北的罗炳辉部保持经常接触。罗也开始得到取道六支队控制区南下的八路军的一些增援。显然，在苏北和苏中，一场重大的对抗正在激化。
这时江南指挥部的情况很糟。国民党的司令官冷欣和顾祝同严格限制他们的活动，致使毛和刘逐渐放弃了在这一地区建立巩固根据地的打算。在春末夏初之际，陈毅将其第一和第二支队大部转移到江北。9 月，第三支队也尾随渡江，到达第四支队的驻地巢湖附近。只剩下叶挺和项英下面的军部直属部队仍留在长江南岸，驻皖南泾县。
当军事形势朝着摊牌的方向发展时，国民党和中共的代表于1940年6 月开始谈判。争论的是共产党的作战区域和中共领导的军队的核准的规模。建议与苛刻的反建议你来我往，未能达成协议。国民党认为，除晋南仍留作阎锡山的辖区外，允许中共在1938年前的黄河故道以北自由统治是一个让步。作为回报，八路军和新四军所有部队应撤离华中。实质上，国民党是向中共提供中共已占有的地区，以换取它放弃可能将用武力取得的地区。国民党当局发出了一系列截止日期，但没有明确指出违反这些规定会有什么后果。
表面上，中共似乎部分地照办了。陈毅和江南指挥部的行动可能看上去像是服从，尽管实际上他们是在执行自己上级的命令，而不是国民党人的命令。1940年秋冬之际项英继续拖延和推诿的行为至今仍有点令人不解。或许他已有相当理由感到毛对他已失去信任，一旦抵达长江北岸，他将丧失他的指挥权。此外，延安的指示有时是模棱两可的和矛盾的。或许他还想与国民党的司令官达成关于撤离该地区的行军路线和安全措施的可靠协议。
韩德勤一度在苏北驻有大量部队——估计有7 万人，远超过新四军的数量——阻挡着第六支队的扩展和八路军的进一步南侵。但到仲夏，他认识到必须反对新四军在苏中集结，否则他就要冒把苏中奉送给共产党人的危险。随后发生了一连串混战，而以1940年10月初在苏中黄桥镇附近的一场决战达到高潮。在4 天里，韩的第89军的几支主力部队被歼，其余部队也被击溃。这也给第六支队一个信号，让他们在苏北更积极地活动。后果是韩的一位主要的司令官与中共建立合作关系，另一个投靠了汪精卫的南京政府。虽然韩德勤到1943年仍在江苏保有立足之地，但其实权已被粉碎。黄桥之战在中国报纸上没有作多少报导：国民党不想公开其惨败，而共产党人对这段与其正式接受的统一战线相矛盾的插曲也乐于保持沉默。
完全可以理解的是，在韩德勤失败之后的秋季，国共谈判每下愈况。12月初，蒋介石本人下令，让所有的新四军部队到12月31日止撤出皖南和苏南；到同一期限，全体八路军应撤至黄河以北，一个月后与新四军会合。在叶挺和顾祝同双方代表之间接着展开一场有关行军路线、安全措施以及——令人难以置信——向新四军提供经费和给养以助转移的讨论。12月25日，毛泽东命令项英立即撤离，但直到1941年1月4日，叶和项才真正开始转移。顾祝同的部队几乎立即进行骚扰并击溃了新四军军部部队，包括后勤人员、伤兵和家属以及一些作好战斗准备的部队。在一次变更部署中，他们向西南方向转移到茂林，在那里被国民党军队包围，并在随后的几天中被粉碎。
双方损失都很大。中共方面伤亡约9000人。项英两次试图凭自己的力量冲出包围，均未成功，并被叶挺斥责为擅离职守。叶挺完全接管了这支必败无疑的队伍的指挥权。项英最后成功脱险，但在两个月后因携有新四军的黄金储备而被他的一名卫兵杀害。项英直到最后或者是未能，或者是拒绝前往刘少奇领导的江北地区寻求避难，叶挺不幸被捕并在监狱中度过了这场战争余下的岁月；最后他于1946年获释，但一个月后与其他几个高级党员一起在一次飞机失事中丧生。1 月17日，蒋介石以违抗命令的罪名宣布解散新四军。延安与重庆间的直接联系实际上结束了，而且在许多国民党统治的城市中的中共军事联络处也被封闭。
这就是新四军事变，也被称为皖南事变。显然，这是对韩德勤在苏北和苏中败绩的报复行动，它结束了在江南建立巩固共产党根据地的任何现实机会。然而，从战略意义上讲，这些损失因在更北边取得更大的收获而得到了补偿——事实上，几个月后，经过整编的新四军开始悄悄地重新派遣一些部队进入这一地区，在这里他们进行游击活动，没有安全的根据地。
与围绕黄桥之战的沉默形成鲜明对比，新四军事件成为一个激烈而持久的论战主题。中共控诉这是比第一次“反共高潮”更为严重的第二次“反共高潮”。他们把自己说成是殉难的爱国者，而把他们的对手描绘成：
欲以所谓中日联合“剿共”，结束抗战局面。以内战代抗战，以投降代独立，以分裂代团结，以黑暗代光明。……道路相告，动魄惊心。时局危机，诚未有如今日之甚者。
当然，国民党的回答是，挑衅已有多次并且是严重的，而违反军纪的行为不能宽恕，但他们不愿公布自己败于中共之手的细节，这使全貌含糊不清。中共智胜了这场宣传战，并赢得了可资利用的政治资本。“如果被看作民族英雄具有政治价值，那么做个民族殉难者价值更大……在整个中日战争中，没有一件事比新四军军部在‘忠实执行命令’时被消灭更能提高共产党对国民党的威望了。”
许多关心这次事件的中国人和其他观察家确实感到“震惊”，担心内战重开。虽然内战并未接踵而来，但是以新四军事变为最高点的各次事件，只有极少例外，已被看作第二次统一战线破裂的标志。这种观点有两个错误。首先，中共把统一战线视为一种战略，可以灵活运用于从中央政府的最高层到最小村落的中国各种政治、军事和社会力量。与蒋介石和国民党政权的关系从整体上说是重要的，但决不是统一战线的全部。然而即使对蒋和国民政府，惯常的解释也是错误的。整个战争期间，统一战线的主要目标是阻止国民党人与日本讲和。因此，当中共军队和中央政府军队之间发生像黄桥和茂林那样的大规模冲突而能不导致与日媾和及全面重开内战时，这不是统一战线的终结，而是它的根本的证明。如果蒋介石能多少容忍如此大规模的磨擦，那么对他将来会与日本人和解的担心就能大为减轻。
新四军事变之后，接踵而来的是中共重新组建华中的政治和军事存在。中共中原局和东南局被合并而重新命名为华中局，由刘少奇负责，反映了这一地区对党中央的重要性。新四军也完全改编，并作了重大的调整。陈毅成为新的代理军长（因叶挺在押），指挥7 个师，这些师是这支部队现在分成的。每个师负责一个地区，中共要求在每个地区建立一个根据地（见图15及表22）。实际上，根据地建设是在1940年的磨擦和新四军事变后才开始认真进行的。在以后几年中，第一至四师的作战地区包括不断扩大的被包围的巩固区，在这里，军事统治与党的公开活动、行政控制、群众组织的发展、地方选举以及社会经济改革结合在一起。其他三个地区在半巩固状态和游击状态之间变动。
国共冲突的最坏时期已经过去。当中共文件提到1943年的第三次反共高潮时，它们指的是不加掩饰的政治活动。除相当强大的国民党势力持续时间较长的山东外，敌后中国各派武装之间的均势到1941年中期已变得有利于中共。在随后的几年里，这种优势变得更大，直到1943年年底，共产党人实际上没有受到国内对手的挑战。1943年9 月当蒋介石向国民党中央执行委员会讲话时，在他的头脑中或许已经有了这种思想：“我相信首先我们应清醒地认识到中国共产党问题纯粹是个政治问题，并且应该用政治手段去解决……”在敌后大部分地区，国民党人再也没有能力去试一试任何其他的解决办法。